Caractéristiques et rôle des lymphocytes B dans la ScS

Dans ce projet appelé BIMID (les lymphocytes B dans les IMID), nous émettons l'hypothèse que les caractéristiques et les rôles des lymphocytes B peuvent varier en fonction de l'auto-antigène reconnu au sein d'une même MAI (maladie auto-immune), et de leur localisation.

Les objectifs du projet BIMID sont de mieux caractériser et comparer les sous-populations, les fonctions et les voies intracellulaires des lymphocytes B entre les patients atteints de ScS et les témoins sains, entre les patients atteints de ScS présentant des spécificités d'auto-anticorps différentes (anti-topoisomérase 1 et anti-centromère) et entre les lymphocytes B circulants et résidant dans la peau, afin de mettre en évidence les caractéristiques communes et les différences entre ces populations. (i) Comparer les phénotypes et les fonctions des lymphocytes B collectés auprès de ces 2 sous-populations de ScS différentes avec des sérotypes différents permettra de déterminer si la contribution des lymphocytes B à la physiopathologie de la ScS dépend (i) de la condition auto-immune elle-même (ScS), par opposition au sérotype du patient, ou (ii) des fonctions intrinsèques des lymphocytes B (stade de différenciation, production d'Ac, production de cytokines, principales voies fonctionnelles/d'activation, voie métabolique...). Les objectifs finaux du projet sont (i) de décrypter les caractéristiques et la fonction des lymphocytes B dans ces 2 populations de ScS, (ii) de trouver des marqueurs de diagnostic et/ou de suivi, et (iii) de nouvelles cibles thérapeutiques pour les lymphocytes B.

Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons une combinaison de technologies basées sur le phénotypage approfondi, la transcriptomique et la protéomique à la fois sur les lymphocytes B du sang et des tissus. Premièrement, nous prévoyons d'utiliser une technique innovante, consistant en une approche multiomique en cellule unique (10X Genomics - méthode de profilage immunitaire). Elle permet d'accéder à plusieurs niveaux d'information sur les lymphocytes B : (i) le séquençage du BCR, donnant accès à l'isotype des lymphocytes B, ainsi qu'à l'étendue de la clonalité et des hypermutations somatiques, (ii) l'expression de certaines protéines de surface cellulaire, (iii) l'analyse du transcriptome complet, pour apprécier le programme fonctionnel de ces lymphocytes B spécifiques, et donc leurs rôles pathologiques en termes de production de cytokines et de voies d'activation. Cette approche sera complétée par une analyse approfondie des marqueurs de surface des lymphocytes B. En utilisant une technique de cytométrie en flux spectrale, nous étudierons l'expression de plus de 40 protéines à la surface des lymphocytes B. Cette technologie permettra d'analyser (i) les sous-populations de lymphocytes B qui sont dysrégulées au cours de la ScS, et ainsi d'accéder à des indices pour comprendre leur ontogenèse, et (ii) leurs phénotypes de repos ou d'activation. Ce projet est financé par un soutien du CPER (2 ans, 200 k€).

Cette caractérisation approfondie des lymphocytes B permettra une meilleure compréhension des caractéristiques et, par conséquent, du rôle physiopathologique des lymphocytes B dans la ScS. En effet, nous proposons d'analyser les lymphocytes B par des technologies innovantes qui permettent une caractérisation presque exhaustive de ces cellules. Une telle description intégrative des caractéristiques des lymphocytes B n'a jamais été menée dans la ScS. Elle pourrait aider à élucider leur ontogenèse, en éclairant les événements qui ont conduit à leur émergence et à leur activation, et être utile à la compréhension de leurs rôles pathogènes, en décryptant leur voie d'activation et leurs mécanismes d'action (la synthèse de cytokines, par exemple). Nous comparerons également les lymphocytes B entre des patients ayant des spécificités d'auto-anticorps différentes, qui présentent des atteintes d'organes et des pronostics différents. Cette étude pourrait aider à trouver des voies dysrégulées communes et/ou différentes, et à comprendre comment des lymphocytes B de spécificités différentes pourraient jouer des rôles différents dans la pathogenèse de la ScS. Cela pourrait se faire par leur production d'auto-anticorps (ce qui est suggéré par les résultats précédents de notre équipe (Chepy et al. 2022 ; Chepy, Vivier, et al. 2025)) et/ou la production de cytokines et l'interaction avec d'autres cellules. Comparer les lymphocytes B entre le sang circulant et un tissu affecté (c'est-à-dire la peau) pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels les lymphocytes B sont attirés dans la peau, et comment ils exercent leur rôle pathogène dans le tissu. Ceci est d'une grande importance car, à l'heure actuelle, les thérapies ciblant les lymphocytes B dans les maladies auto-immunes se concentrent principalement sur les lymphocytes B circulants, tandis que leur effet sur les lymphocytes B résidant dans les tissus reste moins certain. Le développement récent des cellules CAR-T pourrait permettre un meilleur ciblage de ces lymphocytes B résidant dans les tissus.

Pour compléter ces approches, nous utiliserons le modèle murin de ScS basé sur l'immunisation répétée de souris C57Bl/6 contre la TOPO-1 en présence d'adjuvant complet de Freund, dont il a été démontré qu'il induit une fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris. Nous maîtrisons ce modèle avec le développement de lymphocytes B autoréactifs spécifiques de la TOPO-1, et nous proposons ici d'analyser les modes d'action des lymphocytes B autoréactifs à la TOPO-1 : Sécrétion d'auto-anticorps anti-TOPO-1 (ATA) et modes d'action indépendants des auto-anticorps : sécrétion de cytokines pro-inflammatoires/fibrosantes, interaction avec d'autres cellules immunitaires, interaction avec les FB/CE (fibroblastes/cellules endothéliales).

Nous étudierons le rôle de l'immunisation contre la TOPO-1 dans l'exacerbation de la fibrose pulmonaire dans un modèle murin bien caractérisé de ScS (modèle à la bléomycine par instillation intrapulmonaire). Les souris seront immunisées de manière répétée contre la TOPO-1, puis recevront une instillation intratrachéale de bléomycine. Nous analyserons l'infiltration et la localisation des lymphocytes B dans les poumons, et dénombrerons et caractériserons les lymphocytes B autoréactifs à la TOPO-1 dans ces poumons en utilisant des approches de cytométrie en flux. Enfin, à partir du sérum des souris immunisées, les IgG ATA seront purifiées par chromatographie d'affinité. En parallèle, à partir des splénocytes, nous trierons les lymphocytes B autoréactifs à la TOPO-1 par cytométrie en flux pour le séquençage V(D)J de leur BCR. À partir de ces séquences, nous produirons des anticorps monoclonaux ATA. Ces anticorps, qu'ils soient purifiés ou monoclonaux, seront ensuite transférés de manière passive à des souris saines ou atteintes de ScS pour étudier leur potentiel pathogène dans l'induction ou l'aggravation de la maladie. La présence de lymphocytes B autoréactifs ATA sera également recherchée dans les organes cibles : nous étudierons leurs phénotypes et leurs fonctions : sécrétion locale d'anticorps, sécrétion de cytokines pro-inflammatoires/fibrosantes... Ce modèle sera utilisé pour évaluer l'intervention thérapeutique ciblant les lymphocytes B autoréactifs à la TOPO-1 avec des thérapies cellulaires spécifiques (développement de cellules CAAR T en collaboration avec l'IHU Immun4Cure).